Ausblick

CRISPR-Cas-Systeme ("Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats") entwickelten sich in Bakterien und Archaea und sorgen für adaptive Immunität gegen Fremd-DNA, wie die von eindringenden Viren. Modifizierte CRISPR-Cas-Systeme haben unsere Fähigkeit, die Genome verschiedener Organismen zu verändern, dramatisch verbessert, und ebneten den Weg für gezielte therapeutische Interventionen, vor allem die Aussicht auf gezieltes Genom-Editing, um genetische Störungen zu korrigieren und möglicherweise eindringende virale Genome zu blockieren. Ich glaube, dass Werkzeuge auf der Basis von Cas9, einem vereinheitlichenden Faktor, der in der Lage ist, RNA, DNA und Protein zu kolokalisieren, eine nie dagewesene Kontrolle über zelluläre Organisation, Regulierung und Verhalten ermöglichen wird. Hier werde ich die CRISPR-Cas-Targeting-Methodik, voraussichtliche technische Fortschritte und mögliche Anwendungen von der Grundlagenforschung bis zur Klinik beschreiben.

Herkunft der CRISPR-Cas-Systeme

Bakterien und Archaea haben adaptive Immunabwehrsysteme entwickelt, um sich gegen fremdes genetisches Material zu schützen. Sie werden als CRISPR-CRISPR-assoziierte Systeme (CRISPR-Cas) bezeichnet und verwenden kurze RNA, um den Abbau von fremden Nukleinsäuren (1-3) zu steuern. CRISPR-Cas-Systeme arbeiten, indem sie Fragmente von eindringenden Phagen oder Plasmid-DNA in CRISPR-Loci einbauen (die Immunisierungsphase), und unter Verwendung der entsprechenden transkribierten CRISPR-RNAs (crRNAs), den Abbau von homologen Sequenzen steuern (4). Jeder CRISPR-Locus codiert erworbene "Spacer" (Fragmente fremder DNA), die durch Wiederholungssequenzen getrennt sind. Die Transkription eines solchen Locus ergibt eine pre-crRNA, die verarbeitet wird, um crRNAs zu erzeugen, die aus Spacer-Repeat-Fragmenten bestehen. Die daraus entstehenden crRNAs führen zur Spaltung von dsDNA-Sequenzen, die zu dem Spacer komplementär sind. Daher wird das CRISPR-System durch Expression oder Abgabe verschiedener crRNAs leicht auf verschiedene dsDNA-Sequenzen ausgerichtet (5-7).

Erstellen von CRISPR-Cas-Systemen

Cas9-Effektor-Nuklease ist ein RNA-gesteuertes dsDNA-bindendes Protein und der erste identifizierbare programmierbare Vereinheitlichungsfaktor, der in der Lage ist, alle drei Arten von sequenzdefinierten biologischen Polymeren zu kolokalisieren, was ihn zu einem unschätzbaren Werkzeug für die Gestaltung lebender Systeme macht. Ein wichtiger Schritt in Richtung einer effektiven Genom-Editierung und Genomregulation ist die Entwicklung von Typ-II-CRISPR-Cas-Systemen, die robuste RNA-gesteuerte Genommodifikationen in multiplen eukaryotischen Systemen ermöglichen (8-10). Das Typ-II-Effektor System besteht aus einer langen Prä-crRNA, die vom Spacer-Repeat-CRSPR-Locus transkribiert wird, dem multifunktionellen Cas9-Protein und einer trans-aktivierenden crRNA (tracrRNA), die für die Verarbeitung der pre-crRNA und die Bildung des Cas9-Komplexes wichtig ist.

Typ II CRISPR-Interferenz ist ein mehrstufiger Prozess (11). Erstens hybridisieren tracrRNAs mit den wiederholten Regionen der pre-crRNA. Zweitens spaltet endogene RNase III die hybridisierten crRNA-tracrRNAs, und ein zweites Ereignis entfernt das 5'-Ende jedes Spacers, wobei reife crRNAs erhalten werden, die sowohl mit der tracrRNA als auch mit Cas9 assoziiert bleiben. Drittens lokalisiert jeder reife Komplex eine Ziel-dsDNA-Sequenz und schneidet beide Stränge. Um ihr Ziel zu erkennen und zu spalten, benötigt crRNA-tracrRNA-Cas9 sowohl Sequenzkomplementarität zwischen dem Spacer und der Target-Protospacer-Sequenz als auch das Vorhandensein einer geeigneten Protospacer-benachbarten-Motiv- (PAM) -Sequenz am 3'-Ende der Protospacersequenz (12). Das PAM ist eine wesentliche Targeting-Komponente, die auch als Selbst- oder Nicht-Selbsterkennungssystem dient, um zu verhindern, dass der CRISPR-Locus selbst ins Visier genommen wird. Bei der Entwicklung eines CRISPR-Targeting-Systems sollten auch unterschiedliche PAM-Anforderungen für verschiedene Typ-II-Systeme berücksichtigt werden. Das bisher am meisten entwickelte System, das von Streptococcus pyogenes, erfordert ein PAM mit der Sequenz NGG, wobei N ein beliebiges Nukleotid sein kann. Typ-II-Systeme können sich in den Details der Prä-crRNA-Produktion und der crRNA-tracrRNA-Verarbeitung unterscheiden (13).

Die Implementierung der CRISPR-Cas-Technologie in einem bestimmten Organismus erfordert die effiziente Rekonstitution der funktionellen crRNA-tracrRNA-Cas9-Einheit. Da Bakterien CRISPR nativ verwenden, kann das System so wie es ist verwendet werden. Die Verwendung der CRSPR-Technologie beim Menschen erfordert jedoch einige Anpassungen. Diese beinhalten die Expression eines human-codon-optimierten Cas9-Proteins mit einem geeigneten Kernlokalisierungssignal und die crRNA und die tracrRNA, die entweder einzeln oder als einzelne Chimäre über einen RNA-Polymerase-III-Promotor exprimiert werden (14, 15). Der gängigste Ansatz besteht darin, eine Chimäre crRNA-tracrRNA, die auch als kurze Leit-RNA (sgRNA) bezeichnet wird, zu exprimieren, was eine vereinfachte Konstruktion und ein robustes Targeting bereitstellt, insbesondere wenn die sgRNA nicht verkürzt ist (16). Diese Methodik wurde bereits verwendet, um die Genome zahlreicher eukaryotischer Modellorganismen zu bearbeiten.

In Richtung Cas9 Therapeutik

Cas9-vermittelte therapeutische Interventionen können zwei Richtungen einschlagen. Die erste beinhaltet ein gezieltes Genom-Editing, um genetische Störungen zu korrigieren (17-19) und möglicherweise eindringende virale Genome zu stören. Die zweite wird Cas9nuclease-Null-Fusionen zur gezielten Genomregulation in einer Weise verwenden, die der Verwendung von Arzneimitteln ähnlich ist, mit dem Vorteil, dass sowohl Repressions- als auch Aktivierungsmodalitäten verfügbar wären. Man könnte möglicherweise mit einem solchen Ansatz eingreifen, um die epigenetische Fehlregulation der Genexpression zu korrigieren, Entzündung und Autoimmunität zu kontrollieren und auch die Transkription von viralen Genen oder sogar viralen Korezeptoren in anfälligen Zelltypen zu unterdrücken.

Die therapeutische Implementierung von Cas9-Systemen erfordert zunächst die Lösung einiger technischer Schwierigkeiten. Zunächst müssen Cas9-codierende Kassetten in vivo effizient an Zielzellen abgegeben werden. Unglücklicherweise sind Cas9-Proteine ziemlich groß; das üblicherweise verwendete Cas9 aus S. pyogenes ist 1,368 Aminosäuren lang. Strategien zur Verringerung der Proteingröße könnten die Verwendung kleinerer Cas9-Orthologe oder die Entwicklung eines minimalen Cas9 durch Entfernen von Domänen umfassen, die für die beabsichtigte Funktionalität nicht wesentlich sind. Das Cas9-Protein könnte dann effizient in virale Vektoren (Adeno-assoziierte Viren, Adenovirale Vektoren und Lentiviren) zur direkten in vivo-Abgabe verpackt werden (20-22). Die Verwendung von streng regulierten Expressionsvektoren zusammen mit der Fähigkeit, sowohl eine vorübergehende als auch eine gesteuerte Freisetzung von Targeting-Reagenzien zu ermöglichen, wird kritisch sein, um die resultierenden Cas9-vermittelten Funktionen auf spezifische Gewebe zu beschränken.

Abgesehen von der Verbesserung der Genabgabe müssen Anstrengungen unternommen werden, um die Spezifität der Cas9-Bindung zu verbessern. Die Lösung dieses Hindernisses ist von größter Wichtigkeit, da selbst hochspezifische Methoden, wenn sie auf eine ausreichende Anzahl von Zellen angewendet werden, zu einer Off-Target-Aktivität führen, die zu einem Risiko der Onkogenese führt. Prospektive Ansätze würden Kooperativität durch Offset-Nicking und Vorspannen der Reparatur in Richtung HR (homologe Rekombination) gegenüber NHEJ (nicht homologe Endverbindung) erfordern. Sehr nützlich wäre auch die Kolokalisation von Ziel- und Donor-DNA über direkte Guide-RNA-Tethering- oder Cas9-Rekombinasen und Transposasen, insbesondere beim Targeting von postmitotischen Zellen, in denen die Funktion der endogenen HR-Maschinerie normalerweise vermindert ist.

Die Vermeidung einer negativen Immunantwort ist ebenfalls kritisch. Die klassische Immunsuppression kann für die Dauer der Behandlung nützlich sein, jedoch weniger für langfristige regulatorische Modifikationen. Ein vielversprechenderer Ansatz wäre die "Humanisierung" der relevanten Peptidfragmente, die für die Immunogenität von Cas9 verantwortlich sind, wie es für Antikörpertherapeutika erreicht wurde (23). Schließlich kann die funktionelle Flexibilität von Cas9 die Nachahmung von Strategien ermöglichen, die von Viren verwendet werden, wie z. B. das Aufbrechen der Haupthistokompatibilitätskomplex-Transportmaschinen (24).

Zusätzliche synergistische Technologien werden benötigt, um das therapeutische Potenzial von Cas9, insbesondere effiziente, zielgerichtete und sichere In-vivo-Gen-Liefervehikel, vollständig zu realisieren. Wenn ex vivo-Genom-Targeting sich als wirksam erweist (z. B. in hämatopoetischen Stammzellen), dann ist die Fähigkeit, modifizierte Zellen schnell abzurufen und zu screenen, kritisch. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die Vielseitigkeit und Benutzerfreundlichkeit von Cas9 zusammen mit seiner einzigartigen Fähigkeit, RNA, DNA und Proteine auf vollständig programmierbare Weise zusammen zu bringen, die Unterstützung bei der Entwicklung eines leistungsstarken ‚Tool Sets‘ für die Regulierung und Überwachung komplexer biologischer Systeme bietet.

Autor: Sebastian Florescu PhD

HOMEPAGE