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Biotecnologie Sanitarie Simulazione n.1 - MIUR Svolgimento Anno scolastico 2018/19

Parte obbligatoria

Premessa

Questa pagina è stata concepita come traccia per una riflessione-correzione in classe degli argomenti proposti dal ministero. nella prima delle due simulazioni dell'anno scolastico 2018/19)

La prima simulazione proposta dal MIUR era centrata sulla struttura della membrana plasmatica e i meccanismi di trasporto, sia dal punto di vista biologico che biochimico. Su questa premessa viene poi richiesto, considerata la tecnologia del DNA ricombinante e la necessità conseguente di modificare la permeabilità dei rivestimenti cellulari per far penetrare il DNA, di argomentare sui trattamenti possibili per ottenere questo risultato. L'ultimo punto riguarda il confronto tra amplificazione in vivo e in vitro del gene di interesse. Parliamo, ovviamente, della parte obbligatoria.

Cominciamo dai primi due quesiti.

Primo quesito: il candidato descriva il modello a mosaico fluido che caratterizza la membrana plasmatica, la sua asimmetria e il ruolo svolto dai suoi diversi componenti.

Secondo quesito: il candidato analizzi i fattori che influenzano la fluidità delle membrane.

Fig. 1

Quando si parla di membrana plasmatica a mosaico fluido (Singer e Nicholson - 1972) la prima immagine (fig. 1) a cui si pensa è il classico doppio strato di fosfolipidi (5nm di spessore) in cui sono immerse proteine e colesterolo.

Studi successivi però sono riusciti a dettagliare meglio la struttura. Ormai si parla di:

  • doppio strato lipidico che non include solo i fosfolipidi;
  • presenza complessa di più tipi di proteine che praticamente svolgono le funzioni principali;
  • carboidrati legati a proteine e lipidi;
  • una compartimentazione in microdomini e quindi di una struttura asimmetrica che riguarda sia il tipo che la disposizione delle molecole

Ma procediamo con ordine prendendo come riferimento la cellula eucariote.

Esaminiamo prima di tutto la parte lipidica costituita da: fosfolipidi, glicolipidi e colesterolo.

Si osservi la figura 2 di lato che, anche se elementare, mette in evidenza la posizione delle singole molecole e in qualche caso anche la forma tridimensionale.

I fosfolipidi sono la parte fluida dela membrana e quindi anche le proteine immerse presenterebbero un alto grado di motilità

I fosfolipidi sono anfipatici cioè comprendono una regione idrofobica o apolare ed una regione idrofila o polare. Per questo motivo si dispongono in due strati con la parte polare rivolta verso l'ambiente extracellulare e intracellulare. Invece, le parti apolari dei due strati si fronteggiano.

Il colesterolo è uno degli steroli più frequenti nella struttura della membrana cellulare degli eucarioti. Anche la sua molecola presenta una parte apolare ed una polare come si evidenzia nell'immagine di sotto.

Fig. 3 - Colesterolo, modello a spazio pieno

La parte apolare è costituita da 4 anelli idrocarburici mentre la parte polare è ridotta al solo gruppo -OH come si può vedere bene dalla sua formula di struttura nel disegno sottostante.

Fig. 4 - Rappresentazione e formula di struttura del colesterolo

Il colesterolo va ad occupare tutti gli interstizi nel doppio strato fosfolipidico; la sua parte polare (-OH) interagisce con la testa polare della molecola fosfolipidica formando un legame ad idrogeno.

Quindi la presenza del colesterolo rende la membrana più rigida e meno permeabile.

I glicolipidi sono macromolecole formate dall'unione di un lipide con un carboidrato.

Fig. 5 - Glicolipide di membrana

Anche i glicoplipidi hanno un gruppo polare formato dal carboidrato che può essere uno zucchero o una piccola catena di zuccheri (cerebrosidi) oppure una lunga catena ramificata di zuccheri (gangliosidi). La parte apolare è invece determinata dall'unione della sfingosina (un amminoalcol insaturo) con un acido grasso.

Fig. 6 - Rappresentazione di un glicolipide (cerebroside)
Approfondiamo la struttura del fosfolipide e prendiamo in esame il fosfolipide più comune nelle membrane cellulari: la fosfatidilcolina o lecitina (Fig. 7 a destra).

La parte polare o testa idrofila è costituita dal gruppo fosfato esterificato in questo caso con la colina. Come si può notare nel disegno la testa polare è collegata al glicerolo. La colina è un nutriente essenziale presente anche nel neurotrasmettitore acetilcolina. Ma non è l'unico composto presente nella testa dei fosfolipidi. Gli altri sono:

  • serina: un aminoacido
  • inositolo: composto biologico simile al glucosio, conosciuto anche come vitamina B7, e coinvolto in molti processi biologici come il signalling cellulare
  • etanolammina: composto organico che ha il ruolo di ammina e alcol; quando è collegata ad un glicerofosfolipide gioca un ruolo molto importante nell'assorbimento intestinale degli acidi grassi

La parte apolare è invece costituita da 2 catene di acidi grassi, saturi o insaturi, a 16 - 18 atomi di carbonio legate anch'esse al glicerolo.

Quindi ricapitolando esiste non solo la fosfatidilcolina ma anche la fosfatidilserina, il fosfatidilinositolo e la fosfatidiletanolammina o cefalina.

Finisce qui l'elenco dei fosfolipidi?

No, non ci dobbiamo dimenticare della sfingomielina. La differenza rispetto agli altri fosfolipidi è che il glicerolo è sostituito dalla sfingosina come si può vedere nell'immagine che segue e c'è una sola molecola di acido grasso. La sfingomielina, guarda caso, è un componente della mielina nelle cellule nervose.

Fig. 8 - Sfingomielina

Ecco una breve ricapitolazione dei lipidi di membrana.

Procedendo dall'immagine in alto a sinistra e proseguendo nel senso delle lancette dell'orologio: Fig. 9 - Rappresentazione della fosfatidilcolina, Fig. 8 - Rappresentazione della sfingomielina, Fig. 4 - Rappresentazione del colesterolo, Fig. 6 - Rappresentazione del glicolipide,
Fissiamo ora l'attenzione sulla fluidità della membrana.

I fosfolipidi possono essere saturi e insaturi a seconda della struttura degli acidi grassi. I fosfolipidi insaturi, a 37°C e quindi alla temperatura corporea, rendono la membrana fluida. Questo significa che i suoi componenti sono liberi di muoversi e che le membrane non devono essere considerate rigidi foglietti statici.

Lo schizzo di lato (Fig. 10) indica l'insieme dei movimenti dei fosfolipidi. I movimenti di rotazione e diffusione laterale sono comuni e spontanei.

I movimenti flip-flop (diffusione trasversale) sono molto rari. Richiedono l'uso di enzimi (flippasi) associati alle membrane e di molta energia. Molto semplice capire il motivo della richiesta di energia: saltare da uno strato ad un altro per la testa polare di un fosfolipide significa dover attraversare tutto lo strato idrofobico.

Una parte dell'asimmetria della membrana plasmatica dipende dalla struttura e dai movimenti dei fosfolipidi. Infatti i movimenti appena descritti fanno variare la distribuzione dei fosfolipidi sui due lati del doppio foglietto. Inoltre alcuni fosfolipidi sono presenti in ambedue gli strati e altri solo in uno.

Osserviamo un'altra immagine sui movimenti delle molecole fosfolipidiche

Fig. 11 - Movimenti a diffusione laterale e trasversale dei fosfolipidi a confronto
La figura 12, di lato, evidenzia che il doppio strato fosfolipidico può avere due fasi
  • Fase cristallina
  • Fase liquido-cristallina

Già sappiamo che la seconda, che determina la fluidità, si verifica a temperatura corporea. Quindi possiamo supporre che la temperatura influisca su questo aspetto.

Infatti al di sotto di una temperatura limite (TC = Temperatura Critica), che è diversa a seconda del tipo di fosfolipide, si ha la comparsa di una nuova fase, solida. La fase solida è caratterizzata dalla cristallizzazione delle catene idrocarburiche. Quindi si ha la perdita della motilità caratteristica della fase liquido-cristallina.

Ma a parità di temperatura cosa succede?

Sulla fluidità della membrana agiscono altri fattori.

  • La lunghezza delle catene idrocarburiche (catene più lunghe significano minore fluidità)
  • La presenza di numerosi doppi legami nelle catene idrocarburiche (in questo caso la fluidità aumenta)
  • L'abbondanza di colesterolo o altri steroidi (più molecole di colesterolo rendono la struttura nel complesso più rigida e meno permeabile)

Questo aspetto è stato trattato nella presentazione sulla cellula procariote in cui si notava come peculiari caratteristiche dei microrganismi procariotici dipendessero proprio dai fosfolipidi di membrana. E a maggior ragione nelle cellule eucarioti.

L'importanza della fluidità di membrana sarà più evidente quando verranno esaminate le funzioni della membrana. Nel frattempo possiamo dire che i lipidi conferiscono alla membrana fluidità e stabilità. Infatti sono la struttura base e formano la barriera tra i due ambienti, in tutti e due i sensi.

Completiamo l'esame dei lipidi di membrana con l'asimmetria. La figura seguente mette in evidenza che i fosfolipidi e i glicolipidi sono distribuiti nei due strati in modo completamente diverso. I glicolipidi si affacciano solo sull'ambiente extracellulare. La fosfatidilcolina è sovrabbondante nello stesso strato mentre la fosfatidilserina, il fosfatidilinositolo e la fosfatidiletanolammina sono disposti solo nello strato che si affaccia verso l'ambiente intracellulare.

Fig. 13 - Asimmetria dei lipidi di membrana
Passiamo ora ad esaminare le proteine.

La figura 14, di lato, evidenzia che le proteine di membrana sono suddivise in due gruppi:

  • intrinseche o integrali o transmembrana
  • estrinseche o periferiche

Le proteine estrinseche o periferiche non attraversano lo spessore della membrana ma sono presenti solo sulla superficie citoplasmatica o extracellulare della membrana stessa. Possono essere rimosse con trattamenti blandi perché sono collegate alle proteine transmembrana o alle teste polari dei fosfolipidi con legami non covalenti.

Le proteine intrinseche o integrali o transmembrana attraversano una o più volte il doppio strato fosfolipidico. Gli aminoacidi che le compongono devono avere quindi catene laterali idrofobiche là dove sono a contatto con le code apolari dei fosfolipidi. Per rimuoverle dalla membrana è necessario distruggere la struttura della membrana stessa. Si tratta di trattamenti drastici a base ad esempio di detergenti.

Fig. 15 - I vari tipi di proteine transmembrana
Fig. 16 - Alcune strutture delle proteine transmembrana

I disegni di sopra evidenziano l'ulteriore distinzione tra le proteine integrali e il fatto che la stessa proteina può attraversare più volte il doppio strato lipidico oppure essere ancorata solo ad un lato. Il secondo disegno specifica la forma nello spazio di alcune proteine integrali. Da sinistra a destra abbiamo un'α-elica singola, un'α-elica multipla e una proteina a barile β (però queste ultime sono state trovate solo nello strato LPS nei batteri Gram-negativi e nella membrana interna di mitocondri e cloroplasti).

Vediamo ora quali sono le funzioni svolte dalle proteine. Le proteine integrali possono essere:

  • recettori
  • trasportatori
  • enzimi
  • proteine di riconoscimento
  • proteine di giunzione e ancoraggio

Cominciamo con i recettori. Questo tipo di proteine sono dotate di un sito che riconosce molecole particolari, i ligandi. I ligandi possono essere proteine o oligopeptidi, ormoni, neurotrasmettitori, farmaci, tossine o parti esterne di un virus o di un microrganismo. Come spiega bene il disegno di sotto (Fig. 17) una volta che il recettore ha riconosciuto il ligando si ha una risposta cellulare o tissutale come ad esempio la modificazione della attività elettrica della cellula.

Fig. 17 - Recettore di membrana 1. ligando in ambiente extracellulare 2. I ligandi si connettono a specifiche proteine recettrici in base alla forma del sito attivo della proteina 3. Il recettore rilascia un messaggero una volta che il ligando si è connesso al recettore.

Esistono diversi tipi di recettori.

Di lato (Fig. 18) si può vedere la struttura di un recettore transmembrana che presenta più domini: uno extracellulare, uno transmembrana e uno intracellulare.

A questa categoria appartengono i recettori ionotropi e metabotropi.

I recettori ionotropi sono i recettori-canale (detti anche canali ionici ligando-dipendenti), quelli la cui apertura causa il flusso di ioni. Tra questi ricordiamo il recettore colinergico nicotinico per il neurotrasmettitore acetilcolina, il recettore per il GABA (tipo A e C), il recettore del glutammato e i recettori serotoninergici.

I recettori metabotropici sono la classe di recettori che, in seguito all'interazione con lo specifico ligando, inducono una cascata di reazioni cellulari. Tra i più importanti i recettori accoppiati alla proteina G. Qualche esempio: il recettore colinergico muscarinico che lega il neurotrasmettitore acetilcolina, i recettori adrenergici della adrenalina e noradrenalina, il recettore del GABA di tipo B, i recettori della dopamina, i recettori oppioidi, i recettori dei cannabinoidi, il recettore della somatostatina. Questi recettori sono anche coinvolti nella prima fase dei processi di trasduzione dei messaggi (vedi organi di senso), coinvolgendo la proteina G.

Nei recettori ionotropi ciascuna subunità è costituita dal dominio legante extracellulare e un dominio transmembrana che comprende a sua volta quattro α-eliche transmembrana, come si può vedere nella figura sottostante.

Fig. 19 - Canali ionici ligando-dipendenti

I recettori metabotropici accoppiati alle proteine G hanno una struttura complessa come si può vedere nella Fig. 20. Sono costituiti da una singola catena polipeptidica formata anche da 1100 residui. La caratteristica strutturale è rappresentata da 7 α-eliche transmembrana, simili a quelle che si trovano nei canali ionici, con un dominio extracellulare N-terminale di lunghezza variabile e un dominio intracellulare C-terminale che è quello collegato ala proteina G.

Fig. 20 - Struttura di un recettore metabotropo accoppiato a una proteina G
Altri recettori ma con funzioni completamente diverse sono le proteine di riconoscimento coinvolte nei processi dell'immunità innata ed adattiva.

Proteine di riconoscimento. Lo schema di lato (Fig. 21) mostra come i patogeni, in questo caso Streptococcus pneumoniae o Pseudomonas aeruginosa che si trasmettono attraverso l'aria, esprimono delle molecole tipiche della loro specie. Ad accogliere tali molecole e a riconoscerle ci sono dei recettori presenti nella barriera anatomica specifica: la mucosa dell'albero respiratorio. Questa mucosa ha ben 7 diversi tipi di cellule che interagiscono tra di loro grazie alle giunzioni di cui parleremo a breve.. Una volta avvenuto il riconoscimento si avvia il processo di trasduzione con la produzione di citochine che richiamano nella sede le cellule dotate di attività fagocitaria.

I microrganismi non patogeni inducono segnali molto deboli.

Proteine di riconoscimento specifico sono presenti anche sui linfociti (immunità adattiva).

Delle proteine addette al trasporto ci occuperemo nel secondo dei quesiti ministeriali.

Le proteine enzimatiche svolgono reazioni metaboliche.

Le proteine di giunzione sono attive nei meccanismi di collegamento tra cellule adiacenti o nelle comunicazioni intercellulari.

Per parlare in modo più dettagliato delle proteine di giunzione prendiamo in considerazione le caderine (Fig. 22, di lato)

Le caderine sono proteine transmembrana e fanno parte delle CAM (cell adhesion molecules). Mediano l'adesione tra cellule in presenza di ioni calcio (Ca2+) ma svolgono anche altre funzioni.

Le caderine sono sintetizzate come polipeptidi lineari e subiscono molte modificazioni post-traduzionali per diventare le proteine che mediano l'adesione e il riconoscimento cellula-cellula. Questi polipeptidi hanno una lunghezza di circa 720-750 aminoacidi. Ogni caderina ha un piccolo componente citoplasmatico, un componente transmembrana, e la massa rimanente della proteina è extracellulare (al di fuori della cellula). L'adesione cellula-cellula è mediata dai domini extracellulari della caderina, mentre la coda citoplasmatica intracellulare si associa con un gran numero di proteine di adattamento e segnalazione (per esempio le catenine con cui si ancorano ai filamenti di actina). La componente transmembrana è formata da ripetizioni di glicoproteine a catena singola.

L'adesione cellula-cellula è legata proprio alla natura glicoproteica che fa rivestire la superficie cellulare di cariche negative. Quindi gli ioni calcio funzionano da collante. Infatti lo ione calcio si inserisce tra due caderine di due cellule diverse. In assenza di tali ioni le cellule si respingerebbero.

Per completare l'argomento delle proteine di giunzione bisogna accennare al loro ruolo nei confronti della matrice extracellulare (MEC). Le cellule creano una matrice extracellulare rilasciando molecole nello spazio extracellulare circostante. Le cellule hanno CAM specifiche che si legano a molecole nella matrice extracellulare (come ad esempio le integrine) e collegano la matrice al citoscheletro intracellulare. La matrice extracellulare può fungere da supporto quando si organizzano le cellule nei tessuti e può anche essere coinvolta nella segnalazione cellulare attivando i percorsi intracellulari quando sono legati ai CAM.

Alla fine dell'esame della componente proteica della membrana cellulare possiamo senz'altro concludere che anche queste biomolecole contribuiscono all'asimmetria di cui abbiamo già accennato. In conclusione ...

L'asimmetria della membrana è legata alla differente distribuzione dei lipidi, delle proteine ma anche dei glucidi nei due strati fosfolipidici. I glucidi, infatti, coniugati sia ai lipidi (glicolipidi) che alle proteine (glicoproteine), come abbiamo visto in questa carrellata di esempi, si affacciano solo sul versante extracellulare.
Fig. 23 - Membrana cellulare

Prima di concludere bisogna accennare a scoperte recenti che testimoniano la dinamicità della membrana cellulare: le zattere lipidiche (lipid rafts). Si tratta di strutture, facilmente individuabili con tecniche di fluorescenza, che hanno uno spessore maggiore rispetto al normale assetto del doppio strato lipidico. Sono aggregati di colesterolo, sfingolipidi e particolari proteine. Il maggiore spessore dipende da code di acidi grassi più lunghe del normale (catene sature e lunghe).

Fig. 24 - Lipid raft

La figura 24 mostra l'organizzazione di una zattera lipidica. Il lato A è quello intracellulare mente il B è extracellulare. 1 porzione di membrana esterna alla zattera, 2 zattera lipidica, 3 zattera lipidica associata a proteine transmembrana, 4 proteina integrale di membrana esterna alla zattera lipidica, 5 glicosilazioni, 6 ancore a GPI, 7 colesterolo, 8 glicolipidi.

La presenza di queste zattere conferma la dinamicità della membrana cellulare e la presenza di microdomini a cui si accennava all'inizio. Le proteine infatti, a seconda delle esigenze funzionali della cellula possono essere reclutate, aggregate e alla fine allontanate. Lo si è dimostrato nei linfociti T. Sfingolipidi e colesterolo sono strettamente impaccati in uno stato liquido ordinato in modo da formare delle zattere o piattaforme che riescono a trattenere proteine specifiche che hanno affinità per questo tipo di lipidi. Le zattere flottano liberamente nella membrana cellulare che è in uno stato liquido disordinato.

Questi microdomini compartimentano i processi cellulari fungendo da centri organizzativi per l'assemblaggio di molecole di segnalazione, influenzando la fluidità della membrana e il traffico di proteine di membrana e regolando la neurotrasmissione e il traffico di recettori.

Vale la pena guardare questo video realizzato e pubblicato dall'università di Harvard dedicato agli studenti di biologia molecolare per apprezzare nei primi minuti molti dei particolari esaminati. Il video è un viaggio all'interno di un globulo bianco e fa scoprire tutti i meccanismi che gli permettono di percepire ciò che lo circonda e di rispondere a uno stimolo esterno. Nelle primissime immagini compare anche la P-selectina che è un'altra molecola CAM che interagisce tra la superficie delle cellule endoteliali e dei linfociti T.

A questo punto avendo esaminato le molecole che formano la membrana cellulare e analizzato le loro funzioni possiamo sintetizzare le funzioni generali delle membrane cellulari:

  • contorno della cellula e barriera di permeabilità tra due matrici, intracellulare ed extracellulare
  • trasferimento tra le due matrici di diverse molecole
  • ricezione di segnali
  • comunicazioni cellula-cellula
  • adesione cellula-cellula e cellula-matrice

A queste funzioni si deve aggiungere anche la capacità di movimento che non è stata trattata in questa sede.

Terzo quesito: il candidato prenda in esame i meccanismi di trasporto passivo dei soluti e ne analizzi la cinetica, utilizzando anche il grafico sopra riportato (fig. 1).

La struttura della membrana cellulare con la sua componente idrofobica rappresenta indubbiamente un ostacolo per il passaggio della maggior parte di ioni e molecole cariche. Mentre per i gas come O2, CO2, NO e le molecole lipofiliche non ci sono problemi. D'altra parte ioni e molecole cariche sono indispensabili per il corretto funzionamento di ogni cellula ed è chiaro quindi che sono stati sviluppati meccanismi di trasporto adatti a superare questi inconvenienti, compreso il passaggio di strutture voluminose..

I sistemi di trasporto attraverso le membrane sono distinti in trasporto passivo ed attivo a seconda che non richiedano energia oppure sì. Il trasporto passivo comprende la diffusione semplice e la diffusione facilitata, entrambi secondo gradiente di concentrazione. La diffusione semplice è indipendente da un vettore ma quella semplificata lo è.

Diffusione semplice

Tutte le molecole o particelle in soluzione possiedono una energia termica (energia cinetica): esse si muovono casualmente, urtano tra loro e cambiano continuamente direzione. Se in una determinata area le molecole sono più concentrate esse si muoveranno spontaneamente verso aree meno concentrate fino a distribuirsi in modo uniforme nell'intero spazio a loro disposizione. In altre parole le molecole si muovono secondo gradiente fino a quando il gradiente non viene eliminato. Il processo è abbastanza rapido a livello cellulare.

La diffusione semplice è:

  • direttamente proporzionale alla temperatura
  • inversamente proporzionale alle dimensioni delle molecole.
Fig. 25 - Diffusione semplice

Nel caso di una cellula il sistema non è certo aperto ma c'è di mezzo una barriera. Ed è qui che nascono i problemi perché apparentemente solo le molecole che possono attraversare la parte lipidica possono diffondere. Cioè le molecole che possono sciogliersi in esso. In altre parole i lipidi, gli steroidi e le piccole molecole lipofile. Da questo dipende anche la velocità di diffusione. Quanto più grande è l’area della superficie della membrana tanto più molecole possono diffondere attraverso di essa nell'unità di tempo (tasso di diffusione). Il tasso di diffusione dipende però anche dallo spessore della membrana; infatti le due grandezze sono inversamente proporzionali. In ogni caso c’è un rapporto lineare tra il gradiente di concentrazione del soluto e la velocità di diffusione come evidenzia la Fig. 1 nel testo ministeriale.

Ma c'è da considerare anche un altro aspetto. Prima di attraversare la parte lipidica le sostanze devono abbandonare la fase acquosa della matrice extracellulare o intracellulare, il che implica rompere i legami idrogeno con l'acqua. Quindi tutte le sostanze che formano pochi legami idrogeno con l’acqua possono entrare più facilmente nel doppio strato lipidico. Questo ci fa capire come mai l'elenco che abbiamo scritto prima deve essere ampliato a: molecole piccole e non polari (ossigeno, anidride carbonica), molecole piccole e polari (acqua, urea, etanolo). Quindi grosse molecole polari come il glucosio non diffondono in questo modo.

Diffusione facilitata

Essendo passivo, il trasporto facilitato non richiede direttamente energia chimica dall'idrolisi dell'ATP, cioè energia metabolica, nella fase di trasporto stessa; piuttosto, le molecole e gli ioni si muovono lungo il loro gradiente di concentrazione come abbiamo visto anche nella diffusione semplice. La differenza sta nel fatto che non avendo le caratteristiche richieste per oltrepassare lo strato lipidico hanno bisogno di proteine carrier o di proteine-canale. Ma quali sono queste molecole? Ioni e piccole molecole cariche e molecole polari come zuccheri, amminoacidi ... cioè le molecole a forte polarità.

Proteine carrier o trasportatrici: traslocano le molecole da una parte all'altra della membrana. La sostanza si lega ad una estremità della proteina e il legame fa cambiare conformazione al carrier e chiudere l'estremità aperta della proteina. Dopo una fase di transizione si apre l'estremità opposta della proteina e la sostanza viene rilasciata ripristinando la situazione iniziale. Proteine-canale (canali ionici): sono delle proteine transmembrana formate da subunità proteiche che attraversano la membrana ripetutamente. Pertanto quando il canale è aperto sono dei veri e propri pori che attraversano la membrana e consentono quindi il passaggio a ioni purché abbiano dimensioni e cariche appropriate. Se non c'è gradiente un canale di questo tipo ha la stessa probabilità di trasferire uno ione in una direzione o nell'altra. Permettono il passaggio rapido e senza ostacoli di decine di milioni di ioni al secondo. Inoltre il processo è altamente specifico in quanto ogni carrier trasporta solo una singola specie di molecole

Confrontando le curve nel grafico 1 del testo ministeriale si può verificare che la velocità di trasporto nella diffusione facilitata è ad ogni concentrazione di substrato notevolmente maggiore rispetto a quanto succede nella diffusione semplice. Nel caso della diffusione facilitata la relazione è lineare a basse concentrazioni per poi saturare ad alte concentrazioni. Il processo è saturabile poiché ad elevati gradienti di concentrazione del substrato si raggiunge una velocità massima di trasporto che è un valore limite al quale tende la cinetica della reazione di trasporto a valori di concentrazione di substrato infiniti. Bisogna infatti considerare che il flusso unidirezionale cresce secondo una curva iperbolica in funzione della concentrazione del substrato che può andare ad occupare tutti i siti di legame della proteina carrier.

Fig. 26 - Schema di diffusione facilitata

Quarto quesito: il candidato spieghi poi mediante quali trattamenti sia possibile modificare la permeabilità dei rivestimenti cellulari nell'ambito della tecnologia del DNA ricombinante.

La risposta a questo quesito è stata stralciata dalla seguente pagina del sito: il DNA ricombinante.

La tecnologia del DNA ricombinante prevede che il gene di interesse, dopo essere stato isolato, venga trasferito nella cellula ospite prescelta (batterio, lievito, cellula eucariote animale o vegetale) attraverso un vettore. Il passo successivo è clonare il gene di interesse cioè amplificarlo in vivo. Ci sono diversi meccanismi che consentono di trasferire il gene di interesse perché si incorpori nel genoma della cellula ospite. I più comuni sono:

  • trasformazione
  • elettroporazione
  • fusione di protoplasti
  • introduzione a pressione di microparticelle
  • microiniezioni
  • trasfezione nelle cellule eucariote tramite liposomi

Alcuni modificano effettivamente la permeabilità cellulare, altri semplicemente la bypassano o ne sfruttano le peculiare struttura molecolare apolare delle code degli acidi grassi.

Inoltre esistono anche metodi che utilizzano come veicolo per il gene esogeno microbi patogeni a cui viene eliminata la patogenicità. Basti ricordare i virus o l'Agrobacterium tumefaciens molto utilizzato in campo agrario ma non sono oggetto di questa presentazione.

La trasformazione è tipica di batteri e lieviti dove avviene spontaneamente come processo di ricombinazione genica. L'immagine di lato descrive il trasferimento di un frammento di vettore da un primo batterio al vettore di un secondo batterio. In laboratorio i batteri vengono inseriti in un brodo di coltura insieme ai plasmidi, vettori di un gene esogeno. Quasi sicuramente alcune cellule introdurranno al loro interno i plasmidi. Ovviamente per farlo devono avere dei recettori specifici, devono essere cioè competenti. A volte la competenza si può indurre, usando, per esempio, CaCl2.

La trasformazione può essere eseguita anche con uno shock termico per far aprire dei pori minuti nella membrana cellulare. I batteri sono inizialmente sospesi in una soluzione concentrata di ioni calcio a bassa temperatura. La temperatura viene portata rapidamente a oltre 40°C per poi ritornare rapidamente a 2 - 4 °C.

L'elettroporazione è un metodo efficace quando bisogna inserire un vettore con il gene esogeno in una cellula batterica, una cellula vegetale o un lievito. Il DNA e le cellule ospiti vengono messe in un terreno di coltura all'interno di cuvette speciali. Si fa passare un piccolo impulso elettrico sufficiente ad aprire simultaneamente dei pori all'interno della membrana cellulare. Se le teste dei fosfolipidi subiscono un riarrangiamento si aprono dei pori idrofili. In caso contrario i pori saranno idrofobici.

Da sinistra a destra: fig. 28 schema di una cuvetta per elettroporazione, fig. 29 pori idrofobici e idrofili dopo elettroporazione, fig. 30 cuvette per elettroporazione

Ovviamente, nel caso di cellule batteriche e vegetali, la parete cellulare è un impedimento alla elettroporazione e bisogna rimuoverla trasformando le cellule in protoplasti. Si può ricorrere ad enzimi come il lisozima che degradano i polisaccaridi costitutivi. Le cellule rimangono vitali se tutto questo si fa in ambiente ipertonico; per esempio in una soluzione di saccarosio al 20%. A volte si possono fondere gli stessi protoplasti, anche di due specie diverse, per incorporare i loro DNA. Il successo di questa operazione però dipende dalla distanza tassonomica che separa le due specie in questione. Maggiore è la distanza, minore sarà la frequenza di ricombinazione.

Il cannone genico è un'altra modalità con cui si possono introdurre all'interno di cellule vegetali particelle di tungsteno o, addirittura, d'oro ricoperte dal DNA esogeno. Lo strumento per "sparare" le microparticelle è visibile nella foto sottostante. Accanto viene indicato lo schema operativo. Come gas propulsore è utilizzato l'elio. In questo caso l'intervento è meccanico.

Da sinistra a destra: fig. 31 cannone genico (strumento da banco), fig. 32 schema operativo del cannone genico

Esattamente come meccanico è il metodo della microiniezione che viene effettuata su cellule animali. Una micropipetta di vetro, di diametro decisamente inferiore a quello cellulare, viene introdotta all'interno del citoplasma. In questo modo si possono inserire più copie del gene esogeno. Il metodo è utilizzato soprattutto nelle cellule embrionali ed è molto complesso. Richiede l'uso di un micromanipolatore ed una particolare abilità da parte dell'operatore. Nella Fig. 33, di lato, si vede una biologa al microscopio invertito che manovra un micromanipolatore di tipo meccanico. Mentre la foto di sotto (Fig. 34) mostra un microscopio invertito dotato di micromanipolatori elettrici, strumentazione per la microiniezione e dispositivo di protezione. Uno strumento molto più sofisticato

Fig. 34

All'appello manca la trasfezione, cioè il trasferimento del gene da clonare all'interno di cellule eucariote. In genere si fa ricorso ai liposomi, sferette delimitate da un doppio strato lipidico (immagine di lato - Fig. 35) in cui si inserisce il gene di interesse. Grazie alla loro struttura i liposomi si fondono con la membrana cellulare e il gene si ritrova automaticamente dentro la cellula. I liposomi vengono utilizzati anche per la somministrazione di farmaci per via topica.

Quinto quesito: il candidato esamini il processo utilizzato per amplificare in vivo (usando cellule ospiti) un frammento di DNA d’interesse e lo confronti con sistemi di clonaggio senza cellule (in vitro), in cui la tecnica di elezione è la Polymerase Chain Reaction (PCR)

Clonaggio in vivo. In microbiologia industriale il sistema ospite-vettore più economico ed efficiente per produrre proteine di vario tipo a partire da geni di interesse usa batteri e plasmidi. I batteri crescono rapidamente perché si replicano in intervalli brevi. Possono essere tenuti sotto controllo facilmente i parametri ottimali della crescita. Si possono usare terreni di coltura a basso costo perché spesso si utilizzano scarti di altre lavorazioni. A loro volta i plasmidi ingegnerizzati possono contenere anche le informazioni necessarie per pilotare il numero delle loro replicazioni. Inoltre una cellula batterica ne può contenere da 500 a 1000. Bisogna ricordare anche che i plasmidi si replicano indipendentemente rispetto al cromosoma batterico. Quindi i plasmidi che contengono il gene di interesse si moltiplicano e quando il batterio si riproduce trasmette il gene di interesse alle due cellule figlie. Il tutto procede in modo logaritmico ed alla fine si potrà dire che il gene è stato clonato in vivo e che è stato prodotto un clone di cellule batteriche con le stesse informazioni genetiche (gene esogeno compreso). Ovviamente per ottenere il clone cellulare di interesse bisogna partire da cellule batteriche di cui si è sicuri che abbiano inserito il vettore ingegnerizzato e quindi bisogna prima procedere alla selezione dei cloni ricombinanti attraverso i classici test di inattivazione inserzionale o di screening bianco-blu.

Fig. 36 - Screening bianco-blu (selezione di cloni ricombinanti)

Clonaggio in vitro. La PCR o reazione a catena della polimerasi, messa a punto negli anni '60 da Kary Mullis, consente di amplificare frammenti di DNA di cui si conoscono le sequenze nucleotidiche iniziali e finali (estremità 3' di entrambi i filamenti del DNA). Con questa tecnica si può partire anche da una sola molecola di DNA e ottenerne microgrammi per scopi diversi. Questo il materiale necessario: il DNA da amplificare, i primer o inneschi (gli oligonucleotidi della lunghezza di 16 - 30 paia di basi azotate che servono a far iniziare il processo), i nucleotidi necessari per la sintesi e una DNA polimerasi termostabile (Taq polimerasi, ottenuta dal batterio Thermus aquaticus la cui temperatura ottimale d'azione è 72°C). La tecnica comprende tre fasi che avvengono a temperature molto diverse: denaturazione (denaturation), ibridazione (annealing), estensione (elongation).

Fig. 37 - Step della PCR

Lo schema è molto chiaro e specifica anche le temperature necessarie a far avvenire correttamente ogni fase. La temperatura più alta riguarda la denaturazione perché solo a più di 90°C si separano i due filamenti di DNA. Il ciclo si può ripetere per un massimo di 40 volte. La potenzialità di questa tecnica è che si può partire dall'intero DNA dell'individuo ma se si usano i primer corretti alla fine si amplificherà solo la porzione desiderata. Nella foto sottostante il termociclatore, lo strumento che avvia in automatico il primo cliclo di tre fasi per poi replicarlo fino a 30 - 40 volte. Vengono utilizzate delle provette apposite in cui sono aggiunte tutte le molecole necessarie per la tecnica.

Fig. 38 - Termociclatore

Il metodo è molto efficace, veloce, sensibile e versatile. Più dettagli nella pagina del sito dedicata alla PCR.

Created By
Loretta Sebastiani
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