DNA fingerprinting Opificio GolinElli

La scena del crimine...

Sulla scena del crimine sono state trovate tracce organiche appartenenti al colpevole. Dall'analisi del DNA si può risalire al colpevole.

3 momenti: Digestione, Elettroforesi, Colorazione

Prima abbiamo fatto pratica con le micropipette

1. Iniziamo con la digestione: aggiungiamo al DNA trovato sulla scena del delitto ( C ), ed a quello di tre sospettati, gli enzimi di restrizione, che frammentano il DNA in parti di lunghezze diverse a seconda dell'individuo, poiché sono in grado di tagliarlo in prossimità di sequenze nucleotidiche specifiche

Un breve passaggio nella centrifuga, per favorire il mescolamento tra DNA ed enzimi e poi si porta a 37ºC per mezz'oretta per velocizzare la digestione.

Nel frattempo, mentre grazie gli enzimi di restrizione lavorano, noi...

Cerchiamo di capire...

In questa esperienza per semplicità non abbiamo utilizzato DNA umano ma plasmidico, quale fonte di materiale da analizzare, in quantità tale da consentire una visualizzazione diretta, mentre nella realtà si sarebbe resa necessaria una preventiva amplificazione del DNA umano trovato, per ottenere risultati osservabili e significativi (PCR)

Mannaggia che persone serie!

Plasmidi, siti di restrizione, enzimi di restrizione, frammenti di DNA.

I batteri, che sono procarioti, contengono DNA anche sotto forma di anelli : i plasmidi ( li incontreremo più volte nelle biotecnologie ) In essi gli enzimi di restrizione individuano delle precise sequenze palindomiche inverse e tagliano in quei punti.

2. Elettroforesi: per fare pratica proviamo a caricare i pozzetti del gel di agarosio con mano ferma, ma delicata. Poi si farà l'elettroforesi vera e propria: i campioni di DNA presenti nei pozzetti migreranno attraverso il gel spinti dal campo elettrico: essendo negativi andranno verso il polo positivo; i frammenti di diversa lunghezza avanzeranno con diverse velocità e, opportunamente colorati, risulteranno visibili.

3. Colorazione: per vedere la corsa dei diversi frammenti bisogna colorarli. Al DNA da mettere nei pozzetti si aggiunge il Loading dye, una miscela di coloranti che permette di fermare la corsa elettroforetica prima che i campioni arrivino al polo positivo, così da non perderli; le due righe di colorante servono a confinare i frammenti: una li anticipa e una li segue. Al gel di agarosio si aggiunge invece il Green Gel Plus, che intercalandosi alle eliche del DNA lo evidenzia nella sua corsa attraverso il gel di agarosio.

Colorazione con Loading Dye e con il Green Gel Plus

Ecco il colpevole!

Per vedere le bande generate dai vari frammenti si utilizza un transilluminatore UV. Ogni lastrina, che ha 8 pozzetti, serve a due gruppi di lavoro; i pozzetti, da sinistra a destra, contengono i DNA: del Colpevole, del 1º indiziato, del 2º e del 3º (di un gruppo e dell'altro). Questo è l'effetto:

Ecco il risultato! Analizziamo le due serie di DNA (C; 1; 2; 3): il colpevole è il 3!

Preparazione del gel di agarosio

Abbiamo anche imparato a preparare il gel di Agarosio. Sciogliendo lo zucchero agarosio in acqua si ottiene, anche con l'aiuto di un moderato riscaldamento, una soluzione di una ben precisa concentrazione, che influenzerà quanto strette sono le maglie del reticolo di gel. Per questo tipo di analisi serve una concentrazione di 0,8 %.

Sara

Pesiamo l'agarosio: quanti grammi servono?

Prabin

Serve una soluzione tampone, per mantenere il DNA in forma ionica: quanti mL?

Alvise

Scaldiamo la soluzione, poi versiamola nello stampo

Ed ecco il gel!

Appena preparato, dopo l'elettroforesi, al transilluminatore UV.

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